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伯乐Bio-Rad垂直电泳槽的使用

发布时间:2023-04-11       点击次数:61

实验材料

?BSA(1 mg/ml),0.05 g的BSA(Sigma-Aldrich Ltd.)溶于50ml ddH2O中,每Eppendorf管约加入1ml溶液,并在-20℃下冷冻。

?预染色marker (Bio-Rad)

?ProMarker(Wealtec)

?两套玻璃板与校正卡,厚玻璃板与U形玻璃板,0.75 mm厚胶条和一个0.75 mm 10齿梳(Wealtec)

?浓度为12%的SDS-PAGE分离胶(0.75 mm);2.31 ml ddH2O,2.8 ml浓度为30%的Acrylamide/Bis(29:1)(Bio-Rad),1.75 ml的1.5M Tris-CL,pH 8.8(Sigma-Aldrich Ltd.),70 μl浓度为10%的SDS(Bio-Rad),70 μl 10 %APS(Bio-Rad),2.8μl TEMED(Bio-Rad)

?5%SDS-PAGE浓缩胶(0.75 mm); 1.7 ml ddH 2 O,0.415 ml 浓度为30%的Acrylamide/Bis(29:1)(Bio-Rad),0.315 ml的1M Tris-CL,pH值为6.8(Sigma),25 μl浓度为10%的SDS(Bio-Rad),25 μl浓度为10 %的APS(Bio-Rad),2.5 μl的TEMED(Bio-Rad)

?10X Tris-Glycine缓冲液(Sigma)

?V-GES灌胶模具(Wealtec)

?V-GES电极与电泳槽(Wealtec)

?制冷恒温金属浴(Wealtec)

?恒温金属浴(Wealtec)

?胶铲(Wealtec)

?考马斯蓝染色缓冲液(浓度为0.1%的考马斯亮蓝 R-250(Bio-Rad)溶于水/甲醇/乙酸(比例: 45:45:10)混合液中)

?脱色缓冲液(水/甲醇/乙酸(比例:45:45:10))

?配有紫外/白光转换板的Dolphin Doc凝胶成像系统(Wealtec)



步骤

灌胶并将胶块置入电极中:

?灌胶之前,用75%的乙醇擦试玻璃板和胶条。向上抬起翼型扳手打开灌胶模具,并将模块水平放置到台面。将玻璃板和胶条按顺序放入V-GES灌胶模具中(图 2)。

?记得将校正卡恰当地插入厚玻璃板与U形玻璃板之间的空隙,以确保胶条插入位置准确。合拢灌胶模具后并直立放置,双手均匀用力向下扣住翼型扳手以关闭灌胶模具。若位置正确,校准卡应该可以正常上下抽拉活动而不被夹在胶条与玻璃板之间。(图3- 5)

?用5 ml分离胶溶液(图 6)制备浓度为12%的SDS-PAGE凝胶,然后用移液管将1 ml乙醇滴入装好的灌胶模具中。等候60分钟使凝胶聚合。当把溶液倒入玻璃板夹层之间时,将移液管嘴直接置于玻璃板之间,缓慢地滴出液体,尽量避免形成气泡。凝胶完成聚合后,移除乙醇,将制备好的浓缩胶溶液倒入到分离胶上。轻轻将0.75 mm 10孔梳子插入玻璃板之间。确保无气泡产生(图 7)。让浓缩胶聚合60分钟。

?在900 ml蒸馏水中稀释100 ml 10 X缓冲液,并添加SDS, 制成zui后浓度为3.5mM的 SDS-PAGE电泳缓冲液。

?将两个翼型扳手均匀施力掰开,从灌胶模具中取出凝胶三明治夹。通过灌胶模具背后留的两个大孔,轻轻向上将三明治夹推出(图 8)。

?将电极放入垂直电泳槽内。贴着电极壁,将凝胶三明治夹垂直方向插入电极中(图 9)。

?把凝胶三明治夹置于合适的位置后,关闭电极门(图10)。

?如只运行一块凝胶,则需要把胶门(很厚的玻璃板)插入到电极空着的一边。将SDS-PAGE电泳缓冲液倒入凝胶三明治夹与胶门之间,直到缓冲液表面距离玻璃板上缘1cm(图 11)。检查是否有渗漏。将1升的SDS-PAGE电泳缓冲液倒入槽内凝胶组件的周围。


样品制备和装载:

?将试管插入至制冷恒温金属浴(4℃),以解冻冷冻牛血清白蛋白(BSA)(1 mg/ml)样品。 然后,加入25μl 4X蛋白染料及75 μl的已解冻牛血清白蛋白溶液。

?把样品加样到凝胶中前, 请在恒温金属浴中以95℃的温度煮沸混合好的 BSA样品、预染标记和 ProMarker,5分钟。

?向凝胶中装载样品前,用100μl的移液器轻轻抽放缓冲液冲洗井孔让样品孔更平滑。在把样品放入凝胶前,做简单离心与混匀保证蛋白溶液浓度不变。在每个孔中注入10μl的蛋白质样品(图 12)。

?将安全盖安装到槽顶部,并将电极导线连接至电源(图 13)。

?开始电泳:90 V运行60分钟,130V再运行60分钟。

?电泳后,将胶铲插入到两玻璃板之间,轻轻来回撬动直到两板分开,把凝胶从玻璃板上移除(图 14)。 除去上层胶,用考马斯亮蓝溶液染色下层分离胶15分钟。

?将凝胶置于脱色缓冲液过夜震荡进行脱色。

?通过Dolphin-Doc凝胶成像分析系统的紫外/白光转换板拍照。



结果

图1. 电泳后的凝胶。左边外侧孔装载预染色marker,右边两个外侧泳道装载Pro-marker。中间的孔装载1 mg/ml的牛血清白蛋白 (BSA)。浓缩胶部分已被除去。


备注

?在12%的分离胶中用恒定电压输出设置对样品进行分离, BSA(66.2 kDa)被地分离到相对于预染色Marker(Bio-Rad)在凝胶中的迁移的位置。

?在制作下层分离胶的同时,将溶液注入玻璃板后, 请使用EtOH溶液或蒸馏水将凝胶处理平整。否则,外道的蛋白质会倾向于向一侧偏斜。

?分离小体积、或者大小体积的蛋白质/多肽时,可能需要使用不同凝胶浓度、分离时间和电压设置。除了向蛋白质样品添加诸如荧光蛋白染色剂等添加剂外,混合物也可能改变蛋白质的迁移特性。

?实验者在组装玻璃板和胶条的过程中务必格外小心。若胶条放置不当,可能导致漏胶。使用校准卡可以更方便地找到胶条的正确位置。

?组装好灌胶模具之后,可在倒入制胶溶液之前, 用移液管往玻璃板夹层注水, 并等待约5分钟,以测试是否有渗漏。

TEL:15216781845