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抗体选择和稀释

发布时间:2023-04-11       点击次数:108

对于任何一种给定的目标抗原,都有不止一种有效抗体。为了缩小选择范围,实验中通常要考虑以下几个方面:

1、分析或者应用类型

2、样品的性质

3、样品的种类

4、抗体宿主的中落泪

5、抗体的标记和检测

样品的性质:根据样品的性质选择合适的抗体至少要考虑以下几个方面

1、要检测的蛋白区域。刺激宿主动物产生抗体的抗原物质种类繁多,包括全长的蛋白、蛋白片段、多肽、整个生物机体(例如细菌)或细胞。免疫原通常在说明书中会有显示(但有一些情况抗原是资料,不能公开)。如果要检测的是一个蛋白片段或全长蛋白的异构体或特定区域,应该选择由该特异片段或区域或者包含该特异片段或区域所制备的抗体。如果要通过FACS去检测活细胞表面蛋白,则要选择由胞外区蛋白抗原制备的抗体。

2、样品的处理工艺。有些抗体要求样品先进行特殊处理。例如,许多抗体只识别降解或变性蛋白,可能因为这样可 暴露藏在二次或三次折叠后蛋白内部的抗原表位。另一方面,有些抗体却只能识别自然折叠状态蛋白上的表位。(Abcam公司用于western blotting的抗体,样品都需进行降解和变性处理,除非在说明书中特别标明)。当搜寻用于免疫组化的抗体时,则应注意有些抗体只适合用于未固定冷冻组织。有时,抗原修复步骤则*,这样可以消除由福尔马林固定所引起的交联,因为有些抗体不能结合福尔马林固定和石蜡包埋组织中的目标抗原。上述限制会在说明书的应用章节中明确标出。

样品的种类

尽管由于具有足够多的同源氨基酸序列,抗体有可能和其它物种的同一靶蛋白反应,但是我们选择抗体时仍然应该选择来源于同一物种的抗原。如果样品不是来自于列表所示的物种之一,不能说明该抗体不可以用来检测这种样品,但是来自该物种的样品未被检测过,因此我们很难推荐它的适用性。根据序列相似性可以预测交叉反应性,值得骄傲的是Abcam在说明书里有ExPASy和NCBI  BLAST的链接,可以比对不同物种来源氨基酸序列的同源性。

选择一抗宿主的类别

一般来说,当用标记二抗来检测非标记一抗时,产生一抗的宿主动物的类别就非常重要。对于免疫组化,产生一抗的宿主应尽可能和样品的宿主种类不同,以避免二抗的免疫球蛋白与样品中内在的免疫球蛋白发生潜在的交叉反应。例如,用于检测鼠源蛋白的一抗就不应来源于小鼠或大鼠,选用来源于兔的一抗和抗兔的标记lgG二抗进行检测,会比较合适。如一抗已直接附有标记,则可避免上述交叉反应发生。对于不含内源性免疫球蛋白样品的检测,宿主的种类选择不用很严格。例如进行western blotting的细胞裂解液就被认为不包含lgG会以50和25kDa的条带出现在在降解和变性样品中,分别相当于lgG分子的重链和轻链。

选择二抗

二抗应来源于一抗的物种。举例来说,如果您的一抗来源于鼠,那么二抗也就应该选择抗鼠的。我们建议仔细核对二抗说明书以确定您要使用的二抗经过测试可用于您的实验。Abcam提供有大量标记各种荧光物质和染色物质的二抗。检查您所用的一抗数据表的底部,将会显示一些合适的二抗。

双重染色体的选择

对培养细胞或组织进行双免疫染色要求非标记一抗来源于不同物种的动物,而二抗则特异性识别其中一种一抗。二抗如果与其它动物来源的免疫球蛋白有交叉吸附,则会再说明书中明确说明。

荧光和染料标签:标签抗体的目的是要看到抗体结合的信息。标签的选择依据以下几个方面

1、检测方法:英冠或有色沉淀。英冠标签会再特定波长的光激发下发光。有多重荧光可供选用,不同荧光标签有*的吸收和激发波长。在结合了合适的底物时,酶标签HRP和AP可以形成有色沉淀。

2、封固剂(只限免疫组化):AEC、Fast Red、INT或是其它的水溶性染色剂均溶于酒精,因此要求使用水溶性封固剂。一上提到的其它有机物要想得到较好的折射率,使用有机封固剂封固。荧光素标签需要水溶性封固剂。胆藻素蛋白(藻青蛋白/藻红蛋白)需要不加甘油的水溶性封固剂,否则会产生淬灭效应。

3、生物素标记的抗体对于信号的放大是很有效的,比如可应用于亲和素-生物素-酶或荧光复合物(通常缩写为ABC试剂)或者亲和素或链霉亲和素结合酶或荧光染料检测法。

未纯化抗体的稀释和浓缩

未纯化抗体中的目标抗体浓度有很大的差异。如果不清楚未纯化抗体样品的浓度,就可以参考下面的“特殊范围”作为估计的指导。

 

组织培养上清

腹水

全抗血清

全抗血清纯化的抗体

WB/斑点杂交

1/100

1/1000

1/500

1ug/ml

IHC/ICC

Neat to 1/10

1/100

1/50-1/100

5ug/ml

EIA/ELISA

1/1000

1/10000

1/500

0.1ug/ml

FACS/流式细胞术

1/100

1/1000

1/500

1ug/ml

IP

1/100

1/50-1/100

1-10ug/ml

浓度估计

1-3mg/ml

5-10mg/ml

1-10mg/ml

 

TEL:15216781845